Preparar Meios de Cultura - Caldo Simples

Caldo Simples - formulação:

• Extrato de carne ............ 0,3 g
• Peptona ......................... 1,0 g
• ClorEto de sódio ............ 0,5 g
• Água destilada .............. 100,0 ml

O ágar simples é obtido adicionando-se 1,0 a 1,5 % de ágar-ágar ao meio de caldo simples (o meio pode ficar um pouco amolecido, a depender da qualidade do ágar). Aumentando-se a concentração de ágar para 2,0% o meio fica bem sólido e pode-se evitar que certos microrganismos se espalhem, como os Proteus.

Preparação

1. Pesar as substâncias e colocá-las em um béquer (a exceção do ágar)

2. Acrescentar a metade dos 100 ml de água destilada ou desmineralizada, medida com uma proveta

3. Dissolver os ingredientes em água agitando continuamente com um bastão de vidro ou com um agitador elétrico (uso de barra magnética), evitando a formação de espuma. Após a formação de uma suspensão homogênea, completar o volume do meio com o restante da água

4. Quando necessário, dissolver os ingredientes do meio de cultura em banho-maria, vapor fluente em autoclave ou utilizando a chama do bico de Bunsen, ou chapa aquecedora elétrica, protegida com tela de amianto, ou ainda em forno de microondas, até a ebulição, agitando sempre. Evitar o aquecimento desnecessário

5. Filtrar em papel de filtro qualitativo para retirar as impurezas

6. Verificar o pH através de potenciômetro ou fita indicadora de pH e ajustar para 7,2 usando solução de ácido lático (0,1 %) ou hidróxido de sódio (1,0 N), com pipeta de 1 mililitro, gotejando aos poucos. O pH do “agar simples” é ajustado antes da adição do ágar-ágar

7. Distribuir 50 ml do meio em tubos de ensaio (5 a 7 ml por tubo)

8. Tamponar os tubos, protegê-los com papel e amarrá-los com barbante

9. Esterilizar em autoclave a 121°C (1 atmosfera de pressão) por 20 minutos. Deixar dois tubos sem esterilizar, incubá-los a 37°C por 24 a 48 horas, para constatar a necessidade de esterilização.

Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma, porém se for necessário utilizar algumas substâncias termolábeis (uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios (aminoácidos, açúcares), as mesmas são esterilizadas à parte ou por filtração utilizando Filtro Seitz ou Filtros contendo membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22um de diâmetro (Millipore, Sartorius), e depois incorporadas, assépticamente, ao meio previamente esterilizado. Ainda, podem ser esterilizados por tindalização, também conhecida como esterilização fracionada (100°C por 1 hora por 3 dias consecutivos, intercalados por incubação entre 30 a 45°C), ou a 110°C por 10 a 15 minutos, a depender do tipo e carga microbiana.

Meios de cultura

Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas (culturas puras), separando-as de espécies contaminantes.

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre outras.

Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos, quando contém agentes solidificantes, principalmente ágar (cerca de 1 a 2,0 %); semi-sólidos, quando a quantidade de ágar e ou gelatina é de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistência intermediária, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da motilidade e também para conservação de culturas; e líquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.

Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto a procedência dos constituintes em naturais ou complexos, quando usa ingredientes com composição química não definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne, cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura) e artificiais, sintéticos ou ainda quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrogênio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as necessidades nutricionais específicas. Quanto a composição química podem ser simples (meios básicos) ou complexos.

Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigência em especial (Ex. caldo e ágar simples).

Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de infusão de cérebro e coração, ágar suco de tomate, ágar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), ágar chocolate (agar simples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80°C), Meio de Tarozzi (com fragmento de fígado - para anaeróbios), Meio de Lowenstein, meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas), etc.