Prova do sulfureto de hidrogênio (H2S)

Permite determinar a capacidade dos microrganismos para produzirem sulfureto de hidrogênio (H2S) a partir de substratos como aminoácidos sulfurados ou compostos sulfurados inorgânicos.

Muitas proteínas são ricas em aminoácidos sulfurados, como a cisteína. Quando estas proteínas estão presentes no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminoácidos que são utilizados como nutrientes. O aminoácido cisteína, na presença da enzima cisteína desulfurase, perde o seu átomo de enxofre que por sua vez é reduzido pela adição de hidrogênio da água para formar H2S. O H2S é então produzido pela hidrogenação (redução) do enxofre orgânico presente no aminoácido cisteína.

Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela redução de compostos sulfurados inorgânicos, como os tiossulfatos (S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contém tiossulfato de sódio alguns microrganismos têm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertação de H2S. Os átomos de enxofre atuam como aceitadores de hidrogênio durante a oxidação dos compostos inorgânicos.

O meio de cultura agar SIM contém peptonas (a cisteína é um dos componentes) e tiossulfato de sódio como substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que atua como indicador da presença de H2S. Como o H2S é incolor, e por conseguinte não é visível, o sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que é um precipitado negro insolúvel. A presença deste composto ocorre ao longo da linha de inoculação e indica que houve produção de sulfureto de hidrogênio (reação positiva). A ausência do precipitado negro evidencia uma reação negativa.

O meio de SIM é um meio semi-sólido que também pode ser usado para detectar a presença ou ausência de mobilidade nas bactérias e a produção de indol.

Prova da utilização do citrato

Permite diferenciar microrganismos atendendo à sua capacidade para usar o citrato como única fonte de carbono.A prova é feita no meio de citrato ou meio de Simmons. Na ausência de glicose ou lactose fermentáveis, alguns microrganismos são capazes de usar o citrato como única fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presença de citrato permease que facilita o transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da célula o citrato é degradado pela enzima citrase, produzindo ácido oxalacético e acetato. Estes produtos são depois convertidos enzimaticamente em ácido pirúvico e CO2. O meio de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova é feita em tubos em rampa, uma vez que o O2 é necessário para a utilização do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre libertação de CO2. Durante esta reação o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sódio (fornecido pelo citrato de sódio) e água para formar carbonato de sódio, que é um produto alcalino. A presença de carbonato de sódio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte. Após incubação, as culturas citrato positivo são identificadas pela presença de crescimento, na superfície da rampa, acompanhado de coloração azul no meio de cultura. Nas culturas citrato negativas a cor do meio mantém-se verde e não apresentam crescimento no meio de cultura.

Prova de Voges-Proskauer - VP

O objetivo é determinar a capacidade dos microrganismos produzirem produtos finais não ácidos ou neutros, como o acetilmetilcarbinol, a partir dos ácidos orgânicos que resultam da metabolização da glicose. Prova feita no meio MR - VP (Methyl Red, Voges - Proskauer).
A adição do reagente de Barritt’s (solução 40% KOH e solução de a-naftol em etanol absoluto) permite detectar a presença de acetilmetilcarbinol (acetoína) que é percursor da síntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formação de um complexo rosa/vermelho que dá essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na cultura, 15 minutos após a adição do reagente de Barritt’s representa uma prova positiva. A ausência dessa cor é uma prova negativa.
Este tipo de fermentação da glicose é característico do E.aerogenes.