Coloração de Gram

Preparo do esfregaço

Suspender uma pequena porção da amostra bacteriana a ser corada em uma gota de água ou solução salina 0,85%, sobre uma lâmina de microscópio, espalhando a gota. Este procedimento deve ser feito com um alça bacteriológica flambada ou um palito de madeira esterilizado. Deixar o material secar e, em seguida, fixá-lo com calor, flambando rapidamente a lâmina acima da chama de um bico de Bunsen.

Aplicação do corante primário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso de corante ou enxaguar a lâmina com água.

Aplicação do fixador

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com lugol; deixar em repouso por um minuto. Descartar o excesso do fixador ou enxaguar a lâmina com água.

Descoloração

Com a lâmina inclinada, despejar algumas gotas de álcool-acetona 1:1 v:v (descolorizador) para remover o complexo cristal violeta-lugol de células Gram-negativas. Este procedimento não pode exceder a cinco segundos, pois o descolorizador poderá remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguar a lâmina com água para remover excesso de solvente.

Aplicação do corante secundário

Cobrir toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixar em repouso por um minuto. Enxaguar a lâmina com água e tocar as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

Microscopia

Examinar a amostra ao microscópio óptico. Na aplicação da técnica de coloração de Gram de organismos desconhecidos, pode-se utilizar como controles uma bactéria Gram-positiva e uma Gram-negativa, conhecidas, preparando-se lâminas com três esfregaços, sendo o esfregaço central o da bactéria desconhecida. Desta forma, as bactérias controles indicarão se a técnica foi ou não bem sucedida. Sugere-se utilização de Bacillus subtilis e Escherichia coli como controles Gram positivo e Gram negativo, respectivamente.

fonte:http://www.fam.br/microrganismos/metodo_coloracao_de_gram.htm